Master-Arbeiten

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2016

Josef Huber:
Double-Strand Break Distributions along high-LET Particle Tracks in Human HeLa Cells
Universität der Bundeswehr München, 2016.
Abstract: Ionizing radiation finds widespread application in cancer treatment because it induces DNA double-strand breaks (DSB), which are causal to the killing of tumor cells and are ultimately required for a patient’s recovery. Based on its clinical relevance, it is of great importance to study the influence of radiation quality on the number of induced DSB. In previous experiments, the number of observed damage sites in the cell for low-LET X-rays matched well with the number of DSB predicted by simulations. However, for high-LET ionizing radiation, a saturation in the number of damage sites was observed that is less than the predicted number of DSB. The cause of this saturation is attributed to the method of visualizing DSB. It is performed by imaging the distribution of proteins like 53BP1 and γH2AX, which are involved in DSB-signalling and form 1 µm-sized ionizing radiation induced foci (IRIF) at these sites. Due to a decreased spacing between consecutive DSB with increasing LET, single DSB can no longer be resolved within the IRIF. The proteins KU70/80 and DNA-PKcs might be a promising alternative to these conventional damage markers, since one copy each binds to the end of double-stranded DNA immediately after damage induction. Thus, for these proteins significantly smaller IRIF are expected, which might allow the visual- ization of single DSB.
The aim of this work was to count every DSB that is induced by high-LET ionizing radiation in human HeLa cells. For this, the IRIF-formation of DNA-PKcs and KU70/80 was tested and examined. Induction of DSB was achieved by irradiation with α-particles and small angle irradiation at the ion microprobe SNAKE with lithium and carbon ions. Visualization of the target proteins’ distribution in the cell was accom- plished through the method of indirect secondary immunofluorescence staining and imaging was performed with the help of a super-resolution STED-microscope.
In the experiments, no IRIF-formation was detected for primary antibodies specifically targeting KU80 and DNA-PKcs after α-irradiation. The abundant presence of 400000 proteins of each type masked the signal of single proteins bound to double-stranded DNA, indicating that the proteins are not suitable for the counting of single DSB in their indistinguishable collective natural state. DNA-PKcs bound to DSB reportedly undergo phosphorylation at Thr2609, which leads to the dissociation from the DSB. Although this way the expected strong localisation at sites of DSB is lost, it allows for the discrimination of DNA-PKcs proteins that are not involved in damage response. Based on these findings in the relevant literature, the experiments were carried out and IRIF-formation for a primary antibody specific to phosphorylated DNA-PKcs was tested positive after α-particle irradiation. Furthermore, particle tracks were visible after lithium and carbon ion irradiation for samples fixed 2, 3 and 5 minutes post- irradiation. Evaluation of 30 particle tracks for each time point yielded an average number of 2.5±0.4 IRIF per micron after 2 minutes, which increased to 3.2±0.6 IRIF per micron 5 minutes after irradiation for lithium ions with LET=116±10 keV/µm. For carbon ions with LET=500±80 keV/µm , the number of observed IRIF increased from 4.1±0.6 per micron to 4.5±0.7 per micron from 2 to 5 minutes after irradiation. The increase for both ion types can be attributed to a delayed accumulation of protein to a fraction of DSB, which become accessible by changes in the conformation of hete- rochromatin at later times. PARTRAC simulations predict 2.7±0.4 DSB per micron for lithium and 10.2±2.2 DSB per micron for carbon ions. The number of observed IRIF for lithium ions exceeded the number from linear scaling of low-LET X-rays and matched well with the predicted number from PARTRAC. However, the observed number of IRIF for carbon ions was only half the number of the predicted DSB by PARTRAC. Thus, it is concluded that the goal of counting single DSB for high-LET irradiation can only be partly fulfilled: up to LET=116±10 keV/µm , the average spacing between DSB can be resolved by the IRIF-size with diameters from 188±36 nm to 205±49 nm. However, at LET=500±80 keV/µm , the decreased average spacing between consecutive DSB can no longer be resolved and is exceeded by the minimal observed IRIF-diameter of 178±40 nm. PARTRAC takes into account that DSB in close vicinity may not be resolvable and provides a reduced number of observable IRIF, which is derived by assigning all DSB within 150 nm to one observable cluster. This results in a predicted number of 3.3±0.3 observable IRIF per micron for carbon ions, which is matched and partly exceeded by the actual observed number of IRIF per micron. This indicates that the experimental results of this thesis are compatible with PARTRAC simulations.
BibTeX:
	@mastersthesis{Huber2016ma,
	  author = {Huber, Josef},
	  title = {Double-Strand Break Distributions along high-LET Particle Tracks in Human HeLa Cells},
	  school = {Universität der Bundeswehr München},
	  year = {2016}
	}
	
Benjamin Schwarz:
Feinstruktur von BRCA1- und Rad51-Foci nach α-Bestrahlung
Ludwig-Maximilians-Universität München, 2016.
Abstract: DNA-Doppelstrangbrüche (DSB) sind kritische Schäden für das Überleben einer Zelle, wobei eine Vielzahl von extra- und intrazellulärer Faktoren zu einem DSB führen können. Aus diesem Grund hat die Natur besonders spezialisierte und dadurch gleichfalls komplexe Methoden zur DSB-Reparatur entwickelt. Einer dieser Prozesse ist die Homologe Rekombination (HR), bei welcher durch ein komplexes Zusammenspiel verschiedenster Proteine, akkumuliert in so genannten Foci, unter Verwendung des homologen Schwesterchromatids, die losen DNA-Enden wieder zusammengefügt werden. Wichtige Schlüsselfunktionen übernehmen dabei die Proteine Rad51 und BRCA1, wobei ihr gesamtes Aufgabenspektrum noch nicht bekannt ist. Die geringe Größe solcher Foci von wenigen 100 nm macht eine Abbildung ihrer inneren Strukturen für herkömmliche Lichtmikroskopie aufgrund der
beugungsbegrenzten Auflösung von 250 nm unmöglich. In dieser Arbeit wurden immunhistochemische Methoden in Kombination mit STED Mikroskopie (STimulated Emission Depletion) verwendet, um die Feinstruktur der Reparaturfoci α-strahlungsinduzierter DSB an Hand von BRCA1 und Rad51 unterhalb der Beugungsgrenze abzubilden und über die Zeit von 24 h zu charakterisieren. Dabei deuten die Ergebnisse der Korrelationsanalyse auf drei Phasen gemeinsamer Aktion am Doppelstrangbruch hin, welche in Early Stage, Processing Stage und Late Stage aufgeteilt werden können. Des Weiteren weisen Intensitätsplots quer durch einzelne Foci gemessen, auf eine lokale Exklusion der beiden Proteine im Zentrum des DSB hin und stärken Hypothesen, welche keinen direkten Protein-Protein-Kontakt beschreiben.

DNA Double-Strand Breaks (DSB) are critical damages for a living cell. A variety of extra- and intracellular factors are able to induce DSB. Therefore, nature developed several specific and complex DSB-Repair mechanisms. One of them is homologous recombination (HR). It depends on a complex interaction between different proteins, accumulating in so called foci. These proteins use the homologous sister chromatid as a template to rejoin the loose DNA ends. The proteins BRCA1 and Rad51 have a key function in HR, but their specific responsibilities are not completely understood yet. The small size of the foci (few 100 nm) rules out a resolution via light microscopy because of the diffraction barrier of 250 nm. During this thesis, immunohistochemistry and STED microscopy (STimulated Emission Depletion) was used to image foci of BRCA1 and Rad51 during the repair of α-radiation induced DSB with a resolution below the diffraction limit. The resulting data of the correlation analysis of BRCA1 and Rad51 imply a subdivision of BRCA1 and Rad51 interaction in 3 phases during HR (early stage, processing stage, late stage). Intensity plots of the localization of BRCA1 and Rad51 show local exclusion within the foci and therefore support predictions of non-existing direct protein interaction.

BibTeX:
	@mastersthesis{Schwarz2016ma,
	  author = {Schwarz, Benjamin},
	  title = {Feinstruktur von BRCA1- und Rad51-Foci nach α-Bestrahlung},
	  school = {Ludwig-Maximilians-Universität München},
	  year = {2016}
	}
	

2015

Johannes Mitteneder:
Erste ortsauflösende Positronen Lebensdauerspektroskopie am Scanning-Positron-Microscope Interface
Hochschule München, 2015.
Abstract: Das Scanning-Positron-Microscope (SPM) ist ein Instrument zur zerstörungsfreien Materialuntersuchung mittels der Positronen Lebensdauerspektroskopie. Positronen sind sensitiv für Materialdefekte wie Leerstellen, Versetzungen oder Korngrenzen.
An Defekten variiert die lokale Elektronendichte und damit die mittlere Lebensdauer der Positronen im Probenmaterial.
An der Universität der Bundeswehr wurde das SPM an einer Labor-Positronenquelle betrieben. Für einen höheren Positronenfluss wird das SPM zukünftig durch das SPM-Interface an die Reaktor Positronenquelle NEPOMUC gekoppelt. Durch den höheren Fluss des Positronenstrahls sollen kürzere Messzeiten erreicht werden.
Das SPM-Interface verbessert die Strahleigenschaften, indem es die Divergenz und den Strahldurchmesser des Positronenstrahls verkleinert. Zusätzlich formt das SPM-Interface die Positronenpulse aus dem kontinuierlichen Positronenstrahl von NEPOMUC.
Die Pulsung des Strahls wird als Startsignal für die Lebensdauermessungen benötigt. Damit passt das SPM-Interface den Positronenstrahl von NEPOMUC an die Bedürfnisse des SPM an.
Am SPM sollen ortsauflösende Positronen Lebensdauerspektroskopie Messungen mit einer Ortsauflösung von unter 1 µm und einer Pulsbreite von weniger als 150 ps erreicht werden. Dazu sind mehrere Stufen der Pulsformung und Fokussierung nötig.
Um die projektierten Ziele des SPM zu erreichen, muss am Abschluss des SPM-Interfaces ein Strahldurchmesser kleiner 200 µm und eine Pulsbreite von unter 250 ps (FWHM) erreicht werden. Die hohen Ansprüche an die Strahleigenschaften am Abschluss des SPM-Interfaces dienen außerdem dem effizienten Einkoppeln des Positronenstrahls in das SPM.
Um die Strahleigenschaften am Abschluss des SPM-Interfaces zu bestimmen, wurden mehrere Messungen durchgeführt. Die Messungen liefern die Grundlage für die Planung des weiteren Aufbaus des SPM an der Quelle NEPOMUC.
Für die Vermessungen des Strahlprofils des SPM-Interfaces wurde der Strahl mit einer Micro-Channel-Plate (MCP) direkt beobachtet. Der Bereich der höchsten Intensität des Positronenstrahls ist kreisförmig mit einem Durchmesser von 4mm FWHM. Das Intensitätsprofil ist gaußförmig. Durch eine Abbildung des Strahls mit einer elektrostatischen Linse auf die MCP konnte ein Strahldurchmesser von 2mm FWHM bei einer Brennweite von mm erreicht werden. Mit dieser Messung kann die kinetische Energie der transversalen Bewegung der Positronen auf 70meV abgeschätzt werden.
Ein rundes Strahlprofil mit gaußförmiger Intensität ist die Voraussetzung für die weiteren Messungen. In dieser Arbeit wurde eine Probenkammer zur ortsauflösenden Lebensdauerspektroskopie für das SPM-Interface gebaut. Die Probenkammer fokussiert den gepulsten Strahl mit Hilfe einer magnetischen Linse. Der magnetisch fokussierte Strahl kann durch Scannig-Spulen über eine Probe gerastert werden. Mit Hilfe der Probenkammer sind so ortsauflösende Messungen zur Bestimmung des minimal erreichbaren Strahldurchmessers möglich.
Als Grundlage für die ortsaufgelösten Messungen muss die erreichbare Zeitauflösung bekannt sein. Die Zeitauflösung ergibt sich durch die totale Zeitauflösung des Detektors und der Pulsbreite der erzeugten Positronenpulse. Für Pulsbreiten von unter 250 ps muss der kontinuierliche Positronenstrahl der Quelle NEPOMUC in mehreren Schritten zu Pulsen geformt werden. Dazu werden am SPM-Interface ein Sägezahn-Vorbuncher und zwei Sinus-Buncher sowie ein Chopper genutzt. Zur Bestimmung der Pulsbreite sind alle Pulsungkomponenten einzeln eingestellt und optimiert worden. Der Zeitfokus kann durch geeignete Einstellungen der Buncher- Amplitude und der Driftgeschwindigkeiten auf den Probenort in der Kammer gelegt werden. Durch die 50MHz Frequenz der Pulsung erreichen die Positronen alle vielfache von 20 ns die Probenposition t_n =n 20 ns (n e N). Liegt der Zeitfokus auf der Probe, ist die zeitliche Verteilung der ankommenden Positronen um t_n minimal. Die FWHM der gemessenen zeitlichen Verteilung (für viele Positronen aus mehreren Pulsen), der im SPM-Interface gepulsten Positronen entspricht der Pulsbreite.
Die Pulsbreite T_Puls wurde auf gute (257+/-3) ps bestimmt. Aus dem Vergleich der Zählrate mit und ohne Pulsung an der Probenposition ergibt sich ein Wirkungsgrad der Pulsung von 70%.
Am späteren Aufbau des SPM werden die im SPM-Interface erzeugten Pulse noch einmal gebuncht. Damit können aus den im SPM-Interface vorgeformten Pulsen schärfere Pulse im Bereich von 150 ps erzeugt werden.
Mit der erreichten Pulsbreite sind die Positronen Lebensdauermessungen mit der für das SPM-Interface gebauten Probenkammer möglich. Die Probenkammer erlaubt durch die im Laufe der Arbeit gebaute Hardware und in LabView programmierte Software vollautomatisierte ortsaufgelöste Positronen Lebensdauermessungen. Um mögliche Einstellungen der elektrischen Potenziale in der Kammer sowie für den Strom der fokussierenden magnetischen Linse für die Messungen zu finden, ist der Strahlverlauf in der Probenkammer mit COMSOL Multiphysics® simuliert worden. Vor den Messungen am SPM-Interface ist die Probenkammer auf Vakuumdichtigkeit und Hochspannungsfestigkeit bis 10 kV getestet worden. Die Tests verliefen problemlos, nach einem längeren Abpumpen wurde ein Druck von 1 10^(-6) mbar erreicht.
Aus den Messungen mit der Probenkammer des SPM-Interfaces soll der minimal erreichbare Strahldurchmesser bestimmt werden. Dazu wurden ortsaufgelöste Messungen durchgeführt. Die Probenkammer des SPM-Interfaces erlaubt einen Scan- Bereich von 1,5 x 1,5 mm. Der Scan-Bereich ist dabei weitestgehend frei von Verzeichnungen.
Durch die Geometrie der Probenkammer und die Abschirmung des Detektors sind Messungen mit geringem Untergrund möglich. Als Untergrund zählen alle 511 keV-Quanten, die nicht von einer Annihilation im Probenmaterial stammen. Das Peak zu Untergrund Verhältnis beträgt 1000. Damit ist die Aufnahme guter Einzelspektren ausgewählter Orte der Probe möglich. Mit Hilfe von Line-Scans ist die Ortsauflösung in der Probenkammer zu (180+-10) µm bestimmt. Um diesen Strahldurchmesser zu erreichen, wurde der Positronenstrahl in der Probenkammer mit der magnetischen Linse des zweiten Remoderators des SPM fokussiert. Durch die Verwendung dieser Linse ist am weiteren Aufbau des SPM ein vergleichbar kleiner Strahldurchmesser auf dem zweiten Remoderator möglich. Der Remoderator wirkt als gepulste Positronenquelle für die Positronen Lebensdauermessungen in der Probenkammer des SPM. Mit einem Quellendurchmesser von ca. 200 µm und der schmalen Energieverteilung des remoderierten Strahls sind Strahldurchmesser um 1 µm beim finalen Aufbau des SPM möglich.
Der Aufbau der Probenkammer des SPM-Interfaces sowie die durchgeführten Messungen waren sehr erfolgreich. Die in dieser Arbeit erreichten Ergebnisse erlauben den finalen Aufbau des SPM. Durch die Kenntnis des Strahldurchmessers kann die Positronen-Strahloptik zum Ankoppeln des SPM an das SPM-Interface effektiv ausgelegt werden. Schon mit dem Aufbau der Probenkammer des SPM-Interfaces sind Positronen Lebensdauerspektroskopie Messungen mit guter Orts- und sehr guter Zeitauflösung möglich.
Positronen Lebensdauermessungen mit einer Pulsbreite von 260 ps, einem Strahldurchmesser von 180 µm und mit einr hoher Intensität von 2000 Counts pro Sekunde sind weltweit einzigartig. Sie sind nur am Scanning-Positron-Microscope Interface mit der in dieser Arbeit gebauten Probenkammer des SPM-Interafces der Universität der Bundeswehr an der Positronenquelle NEPOMUC möglich.
BibTeX:
	@mastersthesis{Mitteneder2015ma,
	  author = {Mitteneder, Johannes},
	  title = {Erste ortsauflösende Positronen Lebensdauerspektroskopie am Scanning-Positron-Microscope Interface},
	  school = {Hochschule München},
	  year = {2015}
	}
	

2014

Johannes Schütze:
Erprobung von Szintillator-Detektoren bei tiefen Temperaturen
Universität der Bundeswehr München, 2014.
BibTeX:
	@mastersthesis{Schuetze2014ma,
	  author = {Schütze, Johannes},
	  title = {Erprobung von Szintillator-Detektoren bei tiefen Temperaturen},
	  school = {Universität der Bundeswehr München},
	  year = {2014}
	}
	
Thomas Vallentin:
A Microbeam Slit System for High Beam Currents
Universität der Bundeswehr München, 2014.
Abstract: A new microbeam slit system for high beam currents of 10 µA was built up to improve the brightness transport of a proton beam with a kinetic energy of up to 25 MeV into the microprobe SNAKE. The new slit system features a position accuracy of less than 1 µm under normal operating conditions and less than 2 µm if the beam is switched on and off [1]. The thermal management with a powerful watercooling and potential-free thermocouple feedback controlled heating cables is optimized for constant slit aperture. The transparent zone is reduced to 0.7 µm due to the use of mechanically lapped tungsten as slit tip material to reduce small angle scattering effects and to reduce the number of ions passing the slits with low energy loss. The slits feature electrical isolation of the slit tip to make slit current monitoring possible, e.g. for tandem feedback control. With the high possible thermal power input of 250 W we could measure for the first time the high-energy beam brightness B_exp of injected beams with high emittances of eps_in = 2pi mmmrad. The brightness B_exp transported into the microprobe was improved to B_exp = 2 µA/(mm2 mrad2 MeV) and therefore brightness loss through the tandem accelerator was around 25 %. The higher transported brightness B_exp gives the opportunity to achieve the high resolution of the single ion, cell irradiation setup [8, 7] ( 320 nm) also at higher current of I_exp = 100 pA for materials analysis [5].
BibTeX:
	@mastersthesis{Vallentin2014ma,
	  author = {Vallentin, Thomas},
	  title = {A Microbeam Slit System for High Beam Currents},
	  school = {Universität der Bundeswehr München},
	  year = {2014}
	}
	

2012

Judith (Seel) Reindl:
Super resolution microscopy of repair foci after ion irradiation of human HeLa cells
Ludwigs-Maximilians-Universität München, 2012.
Abstract: High LET (linear energy transfer) irradiation of living cells using heavy ions generates a high amount of DNA double-strand breaks (DSB) in close vicinity to each other along the ion track. Various repair proteins cluster to the damage sites, such as gH2AX and 53BP1, forming so-called repair foci of a gross size of about 1 µm. Due to the fact that one focus covers more than one DSB, a fine-structure within the focus can be expected. First indications for such a fine-structure were found in wide field images of
cells taken one hour after irradiation with 55MeV carbon ions in a 5x5 µm matrix performed at the ion microprobe SNAKE. While a typical focus with the diameter of about 1 µm can be easily resolved using a conventional fluorescence microscope, its substructures cannot be resolved due to the diffraction limit of about 250 nm in conventional fluorescence microscopy. Therefore, for analyzing foci fine-structures systematically, super-resolution microscopy techniques like structured illumination microscopy (SIM), stimulation emission depletion microscopy (STED) or localization microscopy (SPDM) which provide a lateral resolution of about 130 nm (SIM) to 50 nm (SPDM) fwhm are utilized. Since with these techniques the lateral resolution is even better than the z-resolution we used an irradiation configuration, where the cells are irradiated at a small angle to the image plane. Thus, the complete ion track appears as a line within one layer of a 3D microscope image. Due to these improvements the super resolution images clearly indicate a fine-structure when e. g. 53BP1 is stained with two colors.
For quantification of the results the Pearson correlation coefficient is calculated for a pixel wise shift in x-direction as well as in y-direction of one color channel with respect to the other (Van Steensel approach). This proves the existence of a fine-structure of a scale of about 200-230 nm, which becomes obvious by an extra correlation peak with a fwhm of this size. Using the same Van Steensel approach with images where one color marks 53BP1 and the other gH2AX, it can be shown that there is no total correlation of the fine-structure between 53BP1 and gH2AX on the small scale.
Using the product of the difference of the mean (PDM) for 2D profiles the images where one protein is labeled with two colors show large regions with total correlation of the to color channels and only small regions at the rim of the focus with no total correlation. In addition, in the PDM approach two different damage markers each labeled in one color show colocalisation in small regions inside the focus but anticorrelation in the outer regions of the focus. These analysis lead to different results:
first of all a single repair marker seems to cluster systematically to the damage site and not in a random way. Secondly 53BP1 and gH2AX cluster in a different way and therefore no full colocalisation can be reached.
With this experimental and analytical methods it is possible to determine the way of clustering to DSB of one single DNA damage marker to clarify the structure of a DSB and the structure of the chromatin architecture as well as the comparison of two
damage markers to get deeper understanding to the interaction of repair markers and repair proteins and at the end decode the way of DNA repair.
BibTeX:
	@mastersthesis{Reindl2012ma,
	  author = {Reindl, Judith (Seel)},
	  title = {Super resolution microscopy of repair foci after ion irradiation of human HeLa cells},
	  school = {Ludwigs-Maximilians-Universität München},
	  year = {2012}
	}
	

2011

Marcus Moser:
Differential Proton-Proton Scattering Cross Section for energies between 1.9 MeV and 50 MeV
Hochschule München, 2011.
Abstract: We present a phase shift analysis of differential elastic proton-proton scattering cross sections (dδ/dΩ)_pp in the energy range from 1.9 MeV to 50 MeV and laboratory scattering angles θ_lab = 15 . . . 75. It results in an accurate representation of the experimental data by an analytical function for (dδ/dΩ)_pp (E, θ). The average statistical error of the resulting data fit is 0.2%. For a fast evaluation we extract an [E, θ]-matrix for (dδ/dΩ)_pp with a negligible interpolation error smaller than 0.02%. This data may be relevant for data evaluation for hydrogen analysis when using proton-proton scattering.
BibTeX:
	@mastersthesis{Moser2011ma,
	  author = {Moser, Marcus},
	  title = {Differential Proton-Proton Scattering Cross Section for energies between 1.9 MeV and 50 MeV},
	  school = {Hochschule München},
	  year = {2011}
	}
	
Created by JabRef on 24/03/2017.